用于生物柴油生产的酶促反应提取昆虫油脂

     使用传统方法从BSFL生物质中提取脂肪以生产生物柴油需要大量溶剂，较长提取时间和热条件。

     本研究提出了一种酶辅助提取方法，用于从BSFL生物质中提取脂肪以生产生物柴油。在用正己烷提取之前，将不同的蛋白酶用于预处理BSFL生物质。在测试的酶中，复合蛋白酶对预处理最为有效，从而导致最高的脂肪产量（与未经酶处理的提取相比，脂肪产量增加了2.2倍）。

     获得的优化的条件是水与生物质的重量比为4.33：1，酶的量为3.85％，酶促的处理温度为38.1℃，酶处理时间为4.27h，最大脂肪产率为36.09％。

1、实验材料：

      BSFL由台湾苗栗县畜牧研究所提供；使用的五种商业蛋白酶分别是Flavourzyme（风味蛋白酶），Protamex（复合蛋白酶），Chamzyme FP（糜蛋白酶），Bromelain（菠萝茎蛋白酶）和Papain（木瓜蛋白酶），购自Challenge BioproductsCo。，Ltd。（台湾云林市） 包括正己烷（95％）和甲醇（99.5％）的试剂购自Tedia Company，Inc.（美国费尔菲尔德）。

2、实验方法：

2.1、酶处理对脂肪提取的影响

     进行了有无蛋白酶处理的BSFL生物质中脂肪的溶剂萃取，使用搅拌器将新鲜的BSFL匀浆，然后用不同的蛋白酶处理。在30℃下通过搅拌将10g均质化的BSFL与0.2g蛋白酶和25mL水温育60分钟来进行酶处理。然后将混合物离心，并除去水相。随后在搅拌下将所得生物质在室温下浸入正己烷（1：5，w / v）中60分钟。通过过滤获得含有脂肪的己烷层。然后通过使用旋转蒸发仪除去正己烷来收集脂肪，用无水硫酸钠处理，然后在105℃下干燥过夜至恒重，计算脂肪含量。

2.2、酶辅助溶剂提取的优化

     使用四因子，三级BoxeBehnken设计研究了酶处理因子对提取效率的影响。在100 mL锥形瓶中使用不同的水与生物质重量比（1：1-7：1），酶（1％-7％），处理温度（30-50 ℃）和处理时间（1-7 h）进行酶处理。搅拌。酶处理过程完成后，随后将所得生物质在室温下浸入正己烷（1：5，w / v）中60分钟。然后获得BSFL脂肪，并确定脂肪产量。使用以下等式对确定的脂肪产量与酶处理因子的关系进行RMS建模如下：

      其中Y，X1，X2，X3和X4分别是脂肪产量（％），水与生物量的重量比，酶负载（％），处理温度（C）和处理时间（h）。a0是截距系数；a1-a4是线性系数；a12，a13，a14，a23，a24和a34是相互作用系数；a11，a22，a33和a44是平方系数。使用Minitab 16进行回归分析和方差分析（ANOVA）。然后将开发的模型用于研究因变量的相互影响，并通过求解回归方程来获得最佳条件。

2.3、酶的可重用性

      测试了蛋白酶的可重复使用性以进行酶处理。酶处理过程在优化条件下进行。酶处理过程完成后，将混合物以5000 rpm离心10分钟以实现固/液相分离。将得到的生物质（固相）在室温下浸入正己烷（1：5，w / v）中60分钟以提取BSFL脂肪，然后确定脂肪产量。收集含有蛋白酶的水相，并将其用于新的酶处理过程。

2.4、由提取的脂肪合成生物柴油

      在反应器中将脂肪与甲醇（摩尔比为8：1）和催化剂H2SO4（1％，w / w）混合，并且在搅拌下在75℃下进行酯化反应60分钟。酸催化的酯化反应完成后，将反应混合物转移至分液漏斗中进行相分离。然后将含有生物柴油和BSFL脂肪的上层相引入一个新容器中，以进行碱催化的酯交换反应。酯交换过程是在以下条件下进行的：甲醇与脂肪的摩尔比为6：1；催化剂0.8％NaOH（w / w）和65℃。30分钟后，通过重力分离反应混合物，随后收集含有生物柴油的上层相并在80℃下蒸馏以除去残留的甲醇。然后将所得生物柴油用于生物柴油组成和生物柴油性能测定。

3.1、酶筛选

     如图1所示，未经酶处理的BSFL提取导致脂肪产量低（8.10％）

     与未经酶处理的提取过程相比，提取前用蛋白酶处理生物质能获得更高的脂肪产量。

     在这些生物催化剂中，复合蛋白酶表现出最高的水解活性，提供最高的脂肪产率（18.17％）

菠萝蛋白酶表现出最低的水解活性。

3.2、处理因素对脂肪提取的相互影响

     图2显示了当将处理温度和处理时间保持在恒定值时，水与生物质重量比和蛋白酶负载量对脂肪产量的综合影响。在特定的酶含量下，脂肪产量随水与生物量的重量比增加。然而，当脂肪产量达到最大水平时，较高的水与生物质重量比导致脂肪产量下降。这可能是因为大量的水降低了酶的活性和稳定性，减少了蛋白酶引起的组织和细胞膜的降解，从而减少了提取效率。

     图3说明了蛋白酶负荷和温度对脂肪产量的综合影响，其余因素保持在恒定水平。在任何处理温度下，脂肪产量均随酶负荷的增加而增加。这归因于酶对组织和细胞膜成分降解的积极作用。然而，较高的酶负载水平导致上述趋势的逆转。这可能是因为过量的酶会导致酶聚集，从而限制酶的灵活性并导致酶与底物结合位置的空间位阻，从而降低酶的降解效率。在本研究中，复合蛋白酶的最高活性显示在38.1℃。

     图4显示了处理温度和时间对脂肪产量的综合影响，在指定的温度下，脂肪的含量随处理时间的增加而显着增加。当获得最大脂肪产量时，进一步增加处理时间会导致脂肪产量减少。这种现象可能是因为较长的处理时间可能会增加细胞成分的释放，引起蛋白质脂质聚集体的形成和乳液的稳定化，从而降低了脂肪的提取效率。

3.3、获得最佳的酶辅助提取条件

      通过求解RSM模型[等式（3）]，计算出获得最大响应的最佳条件为：水与样品的重量比为4.33：1，蛋白酶负载为3.85％，处理温度为38.1℃，且处理时间为4.27h，相应的Y=35.28％。为了验证优化结果，在优化条件下进行了实验，实际脂肪产率为36.09％±0.11％。此外，这项研究的脂肪产量高于我们之前的研究（30.2％），其中仅使用正己烷提取BSFL脂肪48小时，差异可能是因为用蛋白酶预处理通过降解组织和细胞膜改善了脂质的释放。

3.4、蛋白酶的可重复使用性

     在本研究中，酶处理过程是在最佳条件下进行的，以研究复合蛋白酶的可重复使用性。如图5所示，复合蛋白酶可以有效地重复使用多达5次以水解BSFL生物质。因此，使用正己烷可有效提取经处理的BSFL生物质，而不会显着降低脂肪产量。该结果表明，复合蛋白酶是酶辅助提取过程中很有希望的蛋白酶，可以重复使用以提高经济可行性。

3.5、BSFL脂肪的特征

     表4列出了提取的BSFL脂肪的特性。提取的脂肪的碘值为90.1g I/100g，这表明提取的脂肪比植物油更饱和。提取的脂肪的酸值为13.4 mg KOH/g，表明脂肪中存在高含量的游离脂肪酸。提取的脂肪的皂化值为227.3mg KOH/g，表明BSFL脂肪的平均摩尔质量为786.8g/mol。因此，这表明酶处理对BSFL脂肪的特性没有显着影响，并且提取的脂肪已被确定为生物柴油合成的合适原料.

3.6、脂肪酸组成

     如表5所示，合成的BSFL生物柴油包含九种脂肪酸，其中月桂酸（31.15％），油酸（27.80％）和棕榈酸（22.63％）是主要酸。合成的BSFL生物柴油包含65.99％的饱和脂肪酸，其组成与以前的BSFL生物柴油相似，其组成是仅使用溶剂未经酶处理（66.5％）从溶剂中提取的脂肪合成的。这表明酶处理过程对BSFL脂肪的脂肪酸组成没有影响。合成的BSFL生物柴油中饱和脂肪酸的含量为65.99％，高于菜籽生物柴油中的饱和脂肪酸的4.3％。结果表明，提取的BSFL脂肪是生物柴油合成的合适原料。

3.7、燃油特性

    合成生物柴油的大多数特性，例如粘度（5.3 mm²/s），酸值（<0.5 mg KOH/g），水含量（300 mg/kg），密度（875 kg/m³），酯含量（98.7％），十六烷指数（50）和闪点（121 ℃）都符合ASTM D6751和EN 14214，表明BSFL生物柴油可以代替石油柴油。

     在BSFL生物柴油的特性中，硫含量强烈取决于反应的类型。合成的BSFL生物柴油中存在硫（0.04％）是因为硫酸被用作生物柴油合成的催化剂。通过使用酶催化的方法生产生物柴油可以消除这一缺陷。在这项研究中，BSFL生物柴油的十六烷指数和粘度优于菜籽生物柴油。这些发现表明，合成的生物柴油具有吸引人的特性，并且可以替代石油柴油。

3.8、技术和经济评估

     图6给出了从BSFL提取脂肪的酶辅助工艺和常规（非酶处理）工艺的建议工艺流程图

     图6A将干燥的BSFL生物质与己烷在混合罐（M-02）中以1：4的比例混合。随后在均质器（H-01）中研磨BSFL生物质，并在固/液（S / L）分离器（S-02）中将细胞碎片与含有BSFL脂肪的己烷相分离。然后通过在蒸发器V-01中除去己烷来获得BSFL脂肪。

     图6B的酶辅助提取方法需要一个额外的混合罐（用于酶处理）和一个S / L分离器（用于分离BSFL生物质和含水酶），但是该方法避免了在脂肪提取步骤中使用均质机（H-01）。

     在测试的蛋白酶中，复合蛋白酶被确定为提取BSFL脂肪的最有效降解酶。

     使用RSM对复合蛋白酶辅助的溶剂萃取进行了优化，最大脂肪产率达到了36.09％，并得到了验证。 

     随后将提取的BSFL脂肪用于生产生物柴油，合成的生物柴油的大多数特性与ASTM规范D6751和欧洲标准EN 14214一致。

     拟议的提取工艺还证明了工业应用的经济可行性。这些结果表明，酶辅助溶剂萃取可能是从BSFL提取脂肪的有效方法，并且合成的BSFL生物柴油可以替代石油柴油。