不同来源蛋白质对马龙鳌虾养殖中动物肠道和水环境中微生物的影响

为了减少由于海洋环境对生态的影响和对业已紧张的野生捕捞渔业的过度开发，并满足日益扩大的水产养殖业对蛋白质的日益增长的需求，研究人员和产业界一直在稳步地从植物和动物饲料中寻找和评估各种鱼粉替代蛋白质来源。特别是，从循环经济的角度来看，黑水虻(BSF)幼虫为开发可再生、可持续的替代蛋白质来源提供了一种新的策略。这种方法也将为开发可持续的蛋白质来源铺平道路，同时减少与温室气体排放相关的传统废物处理，如填埋和焚烧。

近年来，黑水虻幼虫因其良好的营养成分，如蛋白质、脂类、不同功能分子(包括甲壳素、月桂酸、生物活性肽)和不同多糖，已成为潜在的替代蛋白质成分之一。此外，它可以将有机废物或副产品转化为对土地和水的需求较低的昆虫生物量。因此，它成为促进水产养殖循环经济的合适候选。另一方面，尽管植物蛋白在商业水产饲料配方中通常被用作鱼粉的替代品。然而，必需氨基酸的缺乏和抗营养因子(ANFs)的存在使它们无法单独添加到饲料中，因为这往往会导致水生动物消化不良和生长受损。尽管已有研究通过应用发酵或补充限制矿物质等方式来最小化这些缺陷，然而植物蛋白完全替代鱼粉在马龙螯虾(Cherax cainii)等动物肠道健康的作用机制还有待探索。

近年来，高通量测序技术和计算分析技术的发展使得环境DNA (eDNA)样品中微生物群落的检测成为可能。此外，进一步开发eDNA数据库和宏基因组预测工具，可以深入分析改变的环境条件和摄食制度下的微生物组成。本研究采用16S rRNA基因测序方法，对不同蛋白质饲料条件下养殖的马龙螯虾肠道及养殖水体微生物多样性和组成进行分析。

马龙螯虾采购自西澳大利亚Blue Ridge Marron Farm，实验在Curtin水生研究实验室(CARL)完成。170只马龙螯虾随机分配到18个水箱(每个水箱9只，每组3个重复)，在开始喂养试验前驯化7天。试验期间没有进行换水。用过滤网每周清理一次未食用的饲料和粪便。

配制了6种等蛋白质、等脂、等热量的饲料，包括鱼粉（FM）、黑水虻饲料（BSF）、LPN、PBP、SOY和THS饲料(表1)。原料和饲料配方均由Glenn Forrest公司提供。根据AOAC (AOAC, 2005)的方法确定了饲粮的近似成分。每天下午以1.5%的总生物量进行饲喂。在第58、59和60天使用无菌塑料瓶收集200 ml/罐水样，提取水环境中DNA。试验结束时，从18个鱼箱中共收集54条marron(3条/槽)进行肠道微生物测序分析。

1，水环境中微生物群落更加多样化

测序结果分析发现，肠道和水样共产生5731个OTUs(745个共有)，26个门(21个共有)和420个属(229个共有)。其中，肠道54份样品共获得745个OTUs，系统发育划分为21门229属。水样获得5731个OTUs，分为26门420属。气单胞菌是肠道和水中最丰富的细菌。

2，肠道和水中的微生物群落截然不同

相对于肠道，水中alpha多样性的丰富度、Simpson和Shannon测量值显著更高(图1 c)。此外，在水样中发现独特的OTUs和属(191)的数量高于肠道。PCA分析对细菌OTUs进行聚类，发现肠道和水中具有显著不同的微生物组成结构(图1E)。

3，气单胞菌在肠道和水中普遍存在

不动杆菌属、气单胞菌属、黄杆菌属和假单胞菌属在至少一个处理组的肠道和水样中都有很高丰度。水中发现420个属，其中191个属与肠道共有，229个属与肠道共有，表明以蛋白质饲料喂养水生动物影响了水中复杂的细菌相互作用。气单胞菌在肠道和水中均为优势菌。然而，只有SOYG(73%)和SOYW(67%)以及BSFG(37%)和BSFW(18%)在两种不同环境中相对丰度具有相似性(图2A)。除了气单胞菌外，马龙螯虾的肠道微生物群落中还存在着较高丰度的弧菌(20.1%)、hafia-obesumbacterium(18.5%)、Candidatus Bacilloplasma(11.2%)和希瓦氏菌属(8.3%)(图2A)。在所有饲粮组中丰度较高的属中，只有Candidatus Hepatoplasma和弧菌在肠道中的丰度显著高于其他属(图2B)。其他差异细菌有拟杆菌属、产酸拟杆菌属、纳米囊虫属、Cloacibacterium、Propionispira、fusbacter、Devosia和Hirschia(图2B)。

4，蛋白质饮食调节肠道和水中微生物群落

alpha多样性测量结果显示，LPNG的物种多样性高于FMG。此外，与FMG和THSG相比，LPNG组的Shannon和Simpson均匀度有改善。与FMG相比，PBPG和SOYG的Shannon多样性均匀度也更高(图3A)。在745个OTUs中，只有21个(2.8%)被所有饮食组共享。FMG、BSFG、LPNG和THSG组产生的大多数OTU被发现在这些组内和组间共享。PBPG(116)饲料产生的未共享OTUs最高，而THSG组仅获得3个唯一OTUs(图3B)。然而，PBPG组中大多数未共享的OTUs属于相同的分类分支，主要属于弧菌和C. Bacilloplasma。采用非度量多维尺度(NMDS)对不同蛋白质饲粮中肠道样本的细菌OTUs聚类结果如图3C所示。动物饲料在肠道中产生的未共享OTUs最高(图3E)。各饲粮组肠道细菌的相对丰度均显示变形杆菌为优势菌群(72.8%)。只有PBP和BSF饲料组的Tenericutes丰度较高，分别占读取丰度的42.8%和32.4%。然而，Proteobacteria和Tenericutes在所有组的分类reads中占98%。

在水中，alpha多样性测量发现6个不同类群之间的丰富度、Simpson和Shannon指数没有差异 (图3G)。产生的OTU数量(16 498)在6个处理组中也没有太大差异，从984 (FMW)到1190 (BSFW)不等。总体而言，6个水样组只有5.2%(853)的OTUs被共享，其中THSW、PBPW、LPNW和BSFW组分别有3.1%(516)、2.6%(435)、1.9%(314)和1.8%(305)的OTUs被发现是唯一的(图3H)。Bray-Curtis相对丰度差异的PERMANOVA值(R = 0.522, P = 0.032)表明，蛋白质饲料对养殖马龙螯虾水体中微生物群落的迁移起着重要作用(图3I)。尽管动物、昆虫和植物来源在水中的丰富度和多样性不显著，但根据蛋白质饲料来源，PCA分析显示了了显著的样品分离性(R = 0.842, P = 0.001)(图3J-L)，且黑水虻组的OTUs与其他组有显著差异(P < 0.001)。与肠道样品一样，水中细菌大部分属于变形菌纲(59.8%)。在所有类群中，第二大优势门是拟杆菌门(23.2%)和厚壁菌门(16.4%)，然而，在BSFW中，厚壁菌门丰度达到36.6%。与肠道相似，在属水平上，水样中所有类群的气单胞菌均具有优势(36.6%)。

对于差异丰度菌的鉴定发现，SOYG饲粮有利于气单胞菌和梭状芽胞杆菌的生长，而LPNG饲粮有利于Vogesella、Flavobacterium和Pseudomonas的生长。相比之下，FMG、BSFG和THSG组分别增加了弧菌、希瓦氏菌和肥胖哈夫尼亚菌的丰度。在水中，LPNW有利于Desulfovibrio、Prevotella和链球菌的生长，BSF增强了Clostridium、Aquitalea和Lactobacillus, SOYW富集了气单胞菌和乳球菌，PBPW提高了Cloacibacterium和Fimbriiglobus的丰度，THSW提高了Acidovorax和Stella的丰度。

5，预测元基因组的功能特征

Picrust2预测结果表明，动物和昆虫蛋白FM、PBP、THS和BSF与氨基酸、脂肪酸、糖、蛋白质和次生代谢产物的代谢和生物合成有关。此外，全脂BSF幼虫饲料上调了马龙螯虾肠道中甲壳素的降解途径。植物蛋白大豆激活类黄酮的生物合成和一些与细菌复制和发病有关的途径，而LPN主要参与氨基酸的降解(图4)。

6，微生物量化

PBP和BSF饲料中马龙螯虾肠道细菌数量显著高于大豆、LPN和THS，与鱼粉相比差异不显著。与16S Illumina的数据相似，THS饲料喂养的马龙螯虾细胞数最低。在水中，BSF饲料的细胞数最高，显著高于其他试验饲料。除BSF外，PBP和FM的细菌细胞计数相对于THS也较高(表2)。e值(有效率)为89.6,R2为0.998，表明所有样品qPCR数据的可靠性和可重复性。 

家禽副产品（PBP）和黑水虻（BSF）蛋白质源的饲料提高了肠道和水中细菌的多样性，其中包括一些有益菌，表明PBP和BSF蛋白质源饲料可能有利于马龙螯虾养殖。建议进一步研究PBP和BSF中可能影响饮食和水中微生物群落的潜在成分，并进一步研究饲料和粪便物质在决定马龙鳌虾养殖过程中细菌动态的作用。